淺析大鼠CRH基因干擾慢病毒載體的構(gòu)建論文

　　促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)由下丘腦室旁核(PVN)合成，促進腺垂體合成與釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)。CRH 作為應(yīng)激反應(yīng)的中樞起始調(diào)節(jié)因子之一，在應(yīng)激時含量明顯增高。Plotsky等觀察到大鼠新生期母嬰分離引起的應(yīng)激模型中PVN內(nèi)CRH mRNA及CRH 受體1(CRH-R1)表達明顯增多。RNA干擾(RNAi)是一種通過降解靶基因mRNA使靶基因表達減少或沉默的技術(shù)，再結(jié)合慢病毒載體技術(shù)就實現(xiàn)了長期、穩(wěn)定的基因沉默效應(yīng)。本實驗旨在篩選CRH 基因的RNAi有效靶點，構(gòu)建和鑒定CRH 基因RNAi的慢病毒載體，為后期研究CRH 神經(jīng)元敏感化在應(yīng)激反應(yīng)中的作用及機制奠定基礎(chǔ)。

　　材料與方法

　　一、材料

　　包裝細胞293T細胞株(吉凱基因公司);大腸桿菌菌株DH5α、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司);pEGFP-N1-3FLAG Vector(BD 公司);EcoRⅠ/BamHⅠ內(nèi)切酶(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司);限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶(NEB公司);質(zhì)粒DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA 純化試劑盒(Qiagen公司);Mouse Anti-flag(1∶3000)(Sigma公司)。

　　二、方法

　　1.CRH 基因過表達質(zhì)粒構(gòu)建

　　載體GV143質(zhì)粒XhoⅠ/KpnⅠ酶切后，化學(xué)合成目的基因。用XhoⅠ/KpnⅠ酶切化學(xué)合成的含有目的基因的質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物電泳回收后進行定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌。選擇單克隆進行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的過表達質(zhì)粒。用于菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子的引物為：(1)CMV-F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′;(2)EGFP-N-R：5′-CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG-3′。

　　2.RNAi病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建

　　針對CRH mRNA(NM_031019)，設(shè)計并合成4對針對CRH基因的小干擾RNA(siRNA)的核苷酸序列，同時設(shè)計并合成一段無意義序列作為陰性對照。挑取陽性克隆送至上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司測序鑒定，構(gòu)建的4種干擾質(zhì)粒分別命名為KD1、KD2、KD3和KD4。該RNAi病毒載體可同時表達綠色熒光蛋白(GFP)，用于判斷轉(zhuǎn)染效率。根據(jù)Invitrogen公司的Lipofectamine 2000使用說明共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的工具細胞293T細胞。

　　3.CRH基因RNAi有效靶序列篩選

　　分為三組：NC組共轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒和陰性對照病毒載體質(zhì)粒作為陰性對照;CON 組為不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的293T細胞;KD組共轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒和RNAi靶點病毒載體質(zhì)粒(分為KD1、KD2、KD3、KD4，分別含有針對目的基因的不同干擾靶點序列的RNAi病毒載體質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染后24h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染后36h收集細胞抽提蛋白，使用抗GFP抗體Western blot法檢測目的基因的表達情況，進而判斷不同靶點的干擾效果。

　　4.病毒包裝

　　293T 細胞培養(yǎng)至活細胞達70%-80%時轉(zhuǎn)染篩選出的干擾質(zhì)粒和DNA溶液。把稀釋后的干擾質(zhì)粒和DNA混合液與稀釋后的Lipofectamine 2000于5min內(nèi)混合，室溫溫育20min，于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，每瓶細胞加入20ml的PBS液，棄洗液。每瓶細胞中加入含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基25ml，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集轉(zhuǎn)染48h的293T細胞上清液，于4℃、4000 g離心10min，收集上清液;將上清液以0.45μm濾器過濾后置于40ml超速離心管中，4℃、4000 g 離心10-15min，將病毒濃縮液移出。

　　5.病毒生物學(xué)滴度測定

　　測定前1d在96孔板鋪板，每孔加4×104 個293T細胞，體積為100腳莀__M_μl。用系列稀釋的制備的病毒載體分別加入96孔培養(yǎng)板。24h后加入完全培養(yǎng)基100μl。4d后熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。根據(jù)熒光圖片中GFP表達情況，計數(shù)最大稀釋倍數(shù)孔中的帶有熒光的細胞個數(shù)，計算病毒滴度(TU/ml)=(熒光細胞個數(shù)×轉(zhuǎn)染時細胞數(shù)/100×每孔加入病毒稀釋液體積)×1/稀釋濃度。

　　結(jié)果

　　一、CRH 基因過表達質(zhì)粒構(gòu)建

　　CRH 基因過表達質(zhì)粒構(gòu)建GV143載體進行XhoⅠ/KpnⅠ酶切�；瘜W(xué)合成目的.基因，用XhoⅠ/KpnⅠ酶切化學(xué)合成的含有目的基因的質(zhì)粒得到565bp的片段，將其連入酶切載體中。挑單克隆PCR得到845bp的特異性條帶。送200μl進行測序，測序結(jié)果與目標序列完全一致，表明CRH基因過表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。將CRH 基因過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，收集細胞總蛋白。通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染293T的樣品，可以觀察到49kD附近處有特征條帶，其大小和目的基因融合蛋白相比大小相符(見內(nèi)頁4圖4)。轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

　　二、CRH 基因RNAi有效靶序列篩選

　　重組克隆載體PCR鑒定、測序，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，連接入短發(fā)夾RNA(shRNA)的片段的陽性克隆PCR的片段大小為340bp;沒有連接入shRNA的片段的空載體克隆PCR片段大小為299bp。經(jīng)測序分析后確認插入序列正確，說明GV143-CRH中已含有siRNA 模板DNA的片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。從Western blot結(jié)果可以看出，KD2、KD3、KD4靶點對CRH 基因的表達有敲減作用，是有效靶點。我們選擇KD2靶點(siRNA 序列5′-TCAGGAAACTGATGGAGATTATCTCGAGATAATCTCCATCAGTTTCCTGTTTTTTC-3′)進行CRH 基因RNAi慢病毒表達載體的構(gòu)建。

　　三、病毒包裝及生物學(xué)滴度測定

　　干擾質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞后在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光。病毒原液滴度為1.5×109 TU/ml，表明我們已成功構(gòu)建了高滴度的慢病毒載體，病毒成功包裝。

　　討論

　　1981年Vale從綿羊下丘腦中分離出調(diào)節(jié)ACTH釋放的肽，即CRH。CRH 不但在腦組織中分布廣泛，也可廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)組織，中樞內(nèi)以下丘腦含量最高，主要分布于PVN的小細胞中，在其他神經(jīng)核團中也分布有少量CRH。CRH 調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)，參與應(yīng)激反應(yīng)。CRH是通過CRH-R起作用的，CRH-R在腦的不同部位均有表達，目前已知的CRH-R有CRH-R1、CRH-R2和CRH-R3三種亞型。Hsu等報道急性應(yīng)激可引起大鼠丘腦CRH mRNA水平增高，而重復(fù)應(yīng)激不改變CRH mRNA水平，阻斷急性應(yīng)激所誘導(dǎo)的CRH mRNA水平增高的效應(yīng)。慢性應(yīng)激時，CRH神經(jīng)元胞體增大，接受谷氨酸能及去甲腎上腺素能傳入神經(jīng)纖維增多，CRH 釋放增加。

　　RNAi技術(shù)是一種通過觸發(fā)同源RNA 降解使目的基因沉默的技術(shù)，由于具有特異性、高效性、多能性而被廣泛應(yīng)用。RNAi技術(shù)可以利用siRNA或siRNA表達載體快速、經(jīng)濟、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。同時嵌入慢病毒載體技術(shù)，使目的基因整合到宿主的DNA序列，慢病毒介導(dǎo)的基因表達或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定。與其他病毒載體相比，擴大了載體感染細胞的范圍，適用于體內(nèi)基因治療，為研究基因功能提供了更強有力的工具。本實驗在確定CRH 基因存在于PVN的前提下，用Oligoengine軟件，設(shè)計出GC含量在45%-55%的4個shRNA 序列及一個陰性對照序列，連接慢病毒載體GV118，測序鑒定后，將構(gòu)建重組的載體和慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞，然后通過實時PCR靶點篩選出有效的干擾序列。經(jīng)Western blot和實時PCR的鑒定成功構(gòu)建了CRH 的RNAi慢病毒載體，293T細胞包裝后產(chǎn)生了高滴度的病毒顆粒。本實驗為研究PVN 內(nèi)CRH神經(jīng)元敏感化在應(yīng)激反應(yīng)中的作用及進一步研究CRH 基因功能打下了基礎(chǔ)。

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