用SNP array 對一例額外小標記染色體攜帶者的細胞遺傳影響分析論
額外小標記染色體(small supernumerary marker chromosome，sSMC)是人類染色體中，除正常染色體外，額外的1 條結(jié)構(gòu)異常、來源不明的多余染色體，其大小在中期分裂相中一般小于或等于20 號染色體。據(jù)統(tǒng)計，在全世界范圍內(nèi)約有250 萬人攜帶有sSMC。sSMC 的表型效應(yīng)取決于來源、片段大小和常染色質(zhì)所占的比重。此外，sSMC 形態(tài)結(jié)構(gòu)異常且多樣，傳統(tǒng)的核型分析技術(shù)很難明確其構(gòu)成，因此需要更精確的分子遺傳學(xué)技術(shù)來對其進行分析。本研究利用SNP array 對1 例核型分析技術(shù)無法明確鑒別的sSMC 進行檢測并分析其表型效應(yīng)，現(xiàn)報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
男，28 歲，結(jié)婚4 年，配偶孕3 產(chǎn)0，均在懷孕2-3 個月時不明原因流產(chǎn)，非近親結(jié)婚，孕期無接觸有害物質(zhì)，夫妻雙方智力正常，否認家族遺傳病史。為查明流產(chǎn)原因夫妻二人前來安徽省婦幼保健院遺傳中心檢查染色體，G 顯帶核型分析顯示男方為47,XY,+mar，其父母以及配偶核型正常。
1.2 基因組DNA 提取
抽取患者靜脈血2ml 于EDTA抗凝管中，1000r/min 離心10min，留取細胞沉淀，按照QIAamp DNA blood Mini Ki(t 德國Qiagen公司)說明書操作，提取樣本基因組DNA。用洗脫液洗脫DNA，Nanodrop2000 分光光度計(美國Thermo 公司)測定DNA 濃度，保持DNA 樣本吸光度(A260/280nm)為1.7 ～ 1.9，DNA 樣本置-80℃。
1.3 SNP array 檢測 取200ng DNA 樣本(4μl)， 按照Humancyto SNP-12 BeadChip kits 芯片(Illumina 公司)說明書操作進行SNP array 檢測，采用iscan 掃描系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集，用GenomeStudio 軟件分析結(jié)果。
2 結(jié)果
我們將拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)檢測閾值設(shè)為500×103 bp 和20 個探針檢測位點，可信度大于80。結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣本Smoothed LogR 值在4q12-q13.2 區(qū)域顯著增加(探針位置52728324-6955649，大小為16.4Mb)，顯示此區(qū)段發(fā)生了重復(fù)。表明患者sSMC 由4q12-q13.2 構(gòu)成，核型可表示為47,XY,+dup(4q12-q13.2)。
3 討論
sSMC 大小在中期分裂相中一般小于或等于20 號染色體，且形態(tài)異常，因此G 顯帶核型分析技術(shù)僅能夠識別其存在，但不能夠明確其來源。而其它的顯帶技術(shù)，如C 顯帶和N 顯帶，也只能夠用于對sSMC 來源的大致判斷，如是否帶有隨體、著絲粒等。因此對sSMC 的明確鑒別必須依靠其它的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，目前最為直接的方法是顯微切割技術(shù)，但該方法操作繁瑣且工作量大，在臨床上難以推廣。之后相繼出現(xiàn)的熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)，多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)等快速檢測染色體的方法存在探針選擇上的局限，也使得它們在sSMC 的`鑒別中作用有限。SNP array 是近年來建立的一種新型染色體分析技術(shù)，能夠通過對基因組CNVs 進行檢測來快速、精準地得到染色體的不平衡畸變信息。最初SNP array 主要被用于腫瘤以及遺傳病的基礎(chǔ)研究，但最近利用SNP array 在臨床上用于診斷染色體畸變的報道越來越多。如Li 等應(yīng)用SNP array 對81 例流產(chǎn)組織進行染色體檢測，其異常檢出率較傳統(tǒng)核型分析技術(shù)明顯要高。Malgorzata 等利用SNP array 對61 例B 超顯示胎兒異常的孕婦進行產(chǎn)前診斷。本研究中，我們嘗試將SNP array 對1 例sSMC 攜帶者進行檢測，發(fā)現(xiàn)其sSMC 由4q12-q13.2 構(gòu)成，片段大小為16.4Mb。表明SNP array 也能夠很好的應(yīng)用于鑒別sSMC 來源。
sSMC 由于額外常染色質(zhì)的組成差異、染色質(zhì)的嵌合程度及親本染色體的同源性等因素，由sSMC 引起的臨床表型有相當大的個體差異，可以表現(xiàn)正常，也可以表現(xiàn)出嚴重多器官畸形和智力低下等染色體病臨床特征。通常來說，智力低下與sSMC 是否新發(fā)密切相關(guān)，新突變個體智力低下的可能性較大，而家族遺傳的sSMC 攜帶者智力低下的可能性較小。本研究中，患者被發(fā)現(xiàn)攜帶sSMC，而對其父母雙方進行染色體核型分析后沒有異常發(fā)現(xiàn)，因此，我們可以判斷患者的sSMC 不是家族遺傳的，而是新突變的�；诒静±� sSMC 中常染色質(zhì)的組成和含量及其新突變的特點，本病例應(yīng)該存在4q12-q13.2 重復(fù)的臨床表型。目前為止，全世界報道的4q12-q13.2 重復(fù)病例僅為2 例。Mattei 等最先報道了1 例存在4q12-q13 重復(fù)的6 歲女孩，其臨床表型包括智力低下、生長發(fā)育遲緩、小頭畸形以及內(nèi)眥贅皮。之后Shashi 等報道了1 例表型類似病例，并且認為4q12-q13.2 重復(fù)導(dǎo)致的表型較輕微。在本研究中，患者無上述異常，我們推測可能是4q12-q13 重復(fù)導(dǎo)致的表型較輕微，在某些個體甚至無臨床表現(xiàn)，這也能夠解釋為什么至今為止4q12-q13 重復(fù)的病例僅有2 例被報道過。但根據(jù)Buckton 等的研究，sSMC 與生育力低下密切相關(guān)。本研究中，患者夫妻三次妊娠失敗且其它各項生殖檢測均正常，強烈提示患者的妊娠失敗與sSMC 有關(guān)。但sSMC導(dǎo)致生育力低下的原因，目前尚不得而知。
綜上所述，SNP array 能夠檢測傳統(tǒng)核型分析無法檢測到的sSMC，其結(jié)果為全面和準確地描述sSMC 以及為核型-表型相互關(guān)系的研究提供了一種強大的分析法。目前SNParray 已應(yīng)用于不孕夫婦染色體檢測、植入前遺傳學(xué)診斷、產(chǎn)前診斷等輔助生殖領(lǐng)域，為疾病的診斷帶來了新的思路，解決了很多之前檢測方法無法解決的問題，相信在不久的將來一定會得到更廣泛應(yīng)用。
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